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Título : Purificação e atividade biológica de enzima do látex de Asclepias curassavica L.
Autor : Beltrão, Jéssika de Brito
metadata.dc.contributor.advisor: Paula, Carmen Aparecida de
metadata.dc.contributor.referee: Silva, Regislainy Gomes da
Rezende, Simone Aparecida
Paula, Carmen Aparecida de
Palabras clave : Proteases
Cisteína
Látex
Cicatrização de ferida
Fecha de publicación : 2017
Citación : BELTRÃO, Jéssika de Brito. Purificação e atividade biológica de enzima do látex de Asclepias curassavica L. 2017. 55 f. Monografia (Graduação em Farmácia) - Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2017.
Resumen : A pesquisa em produtos naturais é uma das áreas mais tradicionais da Farmácia e da Química no Brasil. Em uma revisão realizada entre 1981 e 2002 foi demonstrado que de um total de 868 fármacos 91 são compostos de origem biológica e de natureza proteica. A Asclepias curassavica L. pertencente à família Apocinaceae é uma planta perene sulamericana e popularmente empregada para, entre outras aplicações, tratamento de feridas e distúrbios gástricos. Fazendo parte dos constituintes bioativos presentes no látex desta espécie vegetal estão os glicosídeos cardiotônicos e enzimas proteolíticas. Estudos prévios, realizados no LAPLAMED/CiPharma da Escola de Farmácia/UFOP mostraram que o extrato bruto do látex da planta Asclepias curassavica L. apresenta atividade caseinolítica, fibrinogenolítica, fibrinolítica e colagenolítica. O presente trabalho mostra a purificação de uma enzima, a asclepaína, presente no látex da planta Asclepias curassavica L. coletada em pastagens da região de Ouro Preto. A purificação da asclepaína envolveu três etapas: precipitação com sulfato de amônio, cromatografia por troca iônica em CM-Sepharose e cromatografia de fase reversa em C8-Sepharose. Os experimentos de caracterização da asclepaína mostraram que essa enzima apresenta uma massa molecular de 24,5kDa, uma temperatura ótima na faixa de 30 a 40oC e um pH ótimo igual a 6,5. A enzima exibiu uma significante atividade gelatinolítica, fibrinogenolítica e fibrinolítica. A enzima exibiu atividade gelatinolítica e eficientemente hidrolisou as cadeias Aα seguida da hidrólise da cadeia Bß do fibrinogênio. O coágulo de fibrina também se mostrou um excelente substrato para a enzima estudada. A classe da asclepaína foi determinada utilizando inibidores específicos da protease, tais como TPCK, PMSF, N'etilmaleimida, TLCK, E-64, e ácido iodoacético. A atividade da enzima foi completamente inibida com 3,12μM de E-64 e significativamente inibida pela iodoacetamida e ácido iodoacético em concentrações acima de 12,5 μM, indicando que a asclepaína é uma cisteína protease. Os resultados obtidos sobre as características bioquímicas e farmacológicas da asclepaína traz grande motivação em avaliar futuramente se essa enzima possui atividade cicatrizante, principalmente voltado para o debridamento de feridas graves, como queimaduras e úlceras de decúbito.
metadata.dc.description.abstracten: Research on natural products is one of the most traditional areas of Pharmacy and Chemistry in Brazil. A review carried out between 1981 and 2002 showed that of a total of 868 drugs 91 are compounds of biological origin and of a protein nature. The plant Asclepias curassavica L. belonging to the family Apocynaceae is a South American perennial plant and popularly used for, among other applications, treatment of wounds and gastric disorders. As part of the bioactive constituents present in the latex of this plant species are cardiotonic glycosides and proteolytic enzymes. Previous studies performed in the LAPLAMED / CiPharma of the School of Pharmacy / UFOP showed that the latex extract of the plant Asclepias curassavica L. shows caseinolytic, fibrinogenolytic, fibrinolytic and collagenolytic activity. The present work shows the purification of an enzyme, asclepaine, present in the latex of the plant Asclepias curassavica L. collected in pastures of the Ouro Preto region. Purification of asclepaine involved three steps: ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography on CM-Sepharose and reverse-phase chromatography on C8-Sepharose. The asclepaine characterization experiments showed that this enzyme has a molecular mass of 24.5kDa, an optimum temperature in the range of 30 to 40ºC and an optimum pH of 6.5. The enzyme exhibited significant gelatinolytic, fibrinogenolytic and fibrinolytic activity. The enzyme exhibited gelatinolytic activity and efficiently hydrolyzed the Aα chains followed by hydrolysis of the Bβ chain of fibrinogen. The fibrin clot also proved to be an excellent substrate for the enzyme studied. The class of asclepaine was determined using specific protease inhibitors, such as TPCK, PMSF, N'-ethylmaleimide, TLCK, E64, and iodoacetic acid. Enzyme activity was completely inhibited with 3.12 μM E-64 and significantly inhibited by iodoacetamide and iodoacetic acid at concentrations above 12.5 μM, indicating that asclepaine is a cysteine-protease. The results obtained on the biochemical and pharmacological characteristics of asclepaine have a great motivation to evaluate in the future if this enzyme has cicatrizant activity, mainly directed to the debridement of serious wounds, such as burns and decubitus ulcers.
URI : http://www.monografias.ufop.br/handle/35400000/530
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