Identificação de receptores de Inositol 1, 4, 5 - Trifosfato (IP3) e o seu papel na ativação da enzima H+ -ATPase de membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

A enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática apresenta um papel fundamental na fisiologia de Saccharomyces cerevisiae e no processo de fermentação. Esta enzima pode apresentar uma conexão com a sinalização de cálcio intracelular, porém esta via ainda não está bem elucidada. Evidências apontam uma relação do IP3 com a ativação da H+-ATPase e a sinalização de cálcio, e que o canal de cálcio Yvc1p pode estar envolvido nesta relação através de um receptor. Neste estudo, com a intenção de identificar os possíveis receptores de IP3 em leveduras, realizamos buscas, in silico, por sequências no genoma de S. cerevisiae que fossem similares aos receptores de IP3 já depositados em bancos de dados públicos. Foi construído um banco de dados com estas sequências já identificadas de receptores de IP3 em eucariotos e realizada a busca por similaridade contra o genoma da S288C utilizando a ferramenta BLASTn. Não foi observada similaridade entre as sequências de receptores descritas para as demais espécies e o genoma da S. cerevisiae. Entretanto, foi possível identificar a partir de um alinhamento múltiplo, diversas regiões conservadas entre as diferentes espécies de cada um dos três tipos de receptores. Em espécies de fungos que possuem o receptor de IP3 já descrito, foi possível observar que estes apresentam, em alguns trechos, conservação dos padrões bem diferentes das demais espécies de eucariotos. Então, essas sequências foram selecionadas e comparadas com o banco de dados de sequências de proteínas do NCBI, utilizando BLASTp online, com o intuito de identificar sequências similares aos receptores de IP3 de fungos ainda desconhecidos. Posteriormente, foi realizado um alinhamento múltiplo entre essas sequências e os motivos conservados foram identificados utilizando-se a ferramenta Pattcom. Para identificar, então, proteínas já descritas em S. cerevisiae que apresentam similaridades com os motivos conservados de receptores de IP3 foi realizado um alinhamento par-a-par local, utilizando a ferramenta BLASTp, dos motivos contra o proteoma da cepa S288C. Foi possível observar que a proteína YER053C-A de S. cerevisiae apresenta similaridade com um dos motivos conservados em alinhamento de sequências de proteínas similares a receptores de IP3 encontradas em fungos. Para verificar se a proteína candidata apresentava envolvimento no fenótipo de interesse foi verificada as interações já descritas da YER053C-A com outras proteínas na literatura utilizando a ferramenta STRING. Foi verificado que a YER053C-A não apresenta interações descritas com as proteínas da via de ativação da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática, mas apresenta interação com proteínas responsáveis pela resposta ao etanol em levedura. Para validar se a YER053C-A interage com a molécula de IP3 foi realizada a técnica de Docking molecular com as ferramentas Dockthor e Autodock Tools. Foi possível observar que a molécula de IP3 em ambas ferramentas se liga na mesma região da proteína, sugerindo o sítio de ligação. Por fim, para testar a técnica empregada neste trabalho, foi verificado se se outras proteínas, já descritas na literatura como candidatas a receptores de IP3 em leveduras, apresentam similaridades com os motivos conservados identificados no presente trabalho. Foi realizado um alinhamento par-a-par local, utilizando a ferramenta BLASTp, dos motivos contra as proteínas candidatas Alg6p, Yvc1p, Sse2p e Swc3p. Verificou-se então, que estas proteínas apresentam similaridade com alguns motivos conservados, e que estas podem também serem receptores de IP3 em S. cerevisiae. Este resultado indica que as proteínas YER053C-A, Alg6p, Yvc1p, Sse2p e Swc3p são fortes candidatas a serem um dos receptores de IP3 em S. cerevisiae. Além disso, a estratégia de bioinformática estabelecida no presente trabalho, foi capaz de identificar receptores moleculares que até então não tinham sido descritos, podendo ser utilizada para identificação de outros receptores moleculares.